組織培養時各種滅菌特點

常用的滅菌方法可分為物理的和化學的兩類，即：物理方法如干熱（烘燒和灼燒）、濕熱（常壓或高壓蒸煮）、射線處理（紫外線、超聲波、微波）、過濾、清洗和大量無菌水沖洗等措施；化學方法是使用升汞、甲醛、過氧化氫、高錳酸鉀、來蘇水、漂白粉、次氯酸鈉、抗菌素、酒精化學藥品處理。這些方法和藥劑要根據工作中的不同材料不同目的適當選用。 
1、培養基用濕熱滅菌
培養基在制備后的24小時內完成滅菌工序。高壓滅菌的原理是：在密閉的蒸鍋內，其中的蒸汽不能外溢，壓力不斷上升，使水的沸點不斷提高，從而鍋內溫度也隨之增加。在0.1MPa的壓力下，鍋內溫度達121℃。在此蒸汽溫度下，可以很快殺死各種細菌及其高度耐熱的芽孢。
注意完全排除鍋內空氣，使鍋內全部是水蒸氣，滅菌才能徹底。高壓滅菌放氣有幾種不同的做法，但目的都是要排凈空氣，使鍋內均勻升溫，保證滅菌徹底。常用方法是：關閉放氣閥，通電后，待壓力上升到0.05MPa時，打開放氣閥，放出空氣，待壓力表指針歸零后，再關閉放氣閥。
關閥再通電后，壓力表上升達到0.1MPa時，開始計時，維持壓力0.1-0.15MPa，20分鐘。
按容器大小不同，保壓時間有所不同，見表。該表所列數字是徹底滅菌很保險的數字，如果容器體積較大，但是放置的數量很少，也可以減少時間。 
培養基高壓蒸汽滅菌所必需的**少時間
容器的體積/mL 在121℃滅菌所需**少時間/min
20-50 15
75-150 20
250-500 25
1000 30
到達保壓時間后，即可切斷電源，在壓力到0.5MPa，可緩慢放出蒸汽，應注意不要使壓力降低太快，以致引起激烈的減壓沸騰，使容器中的液體四溢。當壓力降到零后，才能開蓋，取出培養基，擺在平臺上，以待冷凝。不可久不放氣，引起培養基成分變化，以**培養基無法擺斜面。一旦放置過久，由于鍋爐內有負壓，蓋子打不開，只要將放氣閥打開，大氣壓入，內外壓力平衡，蓋子便易打開了。
對高壓滅菌后不變質的物品，如無菌水、栽培介質、接種工具，可以延長滅菌時間或提高壓力。而培養基要嚴格遵守保壓時間，既要保壓徹底，又要防止培養基中的成分變質或效力降低，不能隨意延長時間。
對于一些布制品，如實驗衣、口罩等也可用高壓滅菌。洗凈晾干后用耐高壓塑料袋裝好，高壓滅局20-30分鐘。
高壓滅菌前后的培養基，其PH值下降0.2-.3單位。高壓后培養基PH值的變化方向和幅度取決于多種因素。在高壓滅菌前用堿調高PH值**預定值的則相反。培養基中成分單一時和培養基中含有高或較高濃度物質時，高壓滅菌后的PH值變化幅度較大，甚**可大于2個PH值單位。環境PH值的變化大于0.5單位就有可能產生明顯的生理影響。
高壓滅菌通常會使培養基中的蔗糖水解為單糖，從而改變培養基的滲透壓。在8%-20%蔗糖范圍內，高壓滅菌后的培養基約升高0.43倍。
培養基中的鐵在高壓滅菌時會催化蔗糖水解，可使15%-25%的蔗糖水解為葡萄糖和果糖。培養基值小于5.5，其水解量更多，培養基中添加0.1%活性炭時，高壓下蔗糖水解大大增強，添加1%活性炭，蔗糖水解率可達5%。
為防止高壓滅菌產生的上訴一些變化可用下列方法：
（1）經常注意搜集有關高壓滅菌影響培養基成分的資料，以便及時采取有效措施。
（2）設計培養基配方時盡量采用效果類似的穩定試劑并準確掌握劑量。如避免使用果糖和山梨醇而用甘露醇，以IBA代替IAA，控制活性炭的用量（在0.1%以下）注意PH值對高壓滅菌下培養基中成分的影響等。
（3）配制培養基時應注意成分的適當分組與加入的順序。如將磷、鈣和鐵放在**后加入。
（4）注意高壓滅菌后培養基PH值的變化及回復動態。如高壓滅菌后的PH值常由5.8升高**6.48。而96小時后又回降**5.8左右。這樣在實驗中就可以根據這一規律加以掌握。
2、用于無菌操作的器械采用灼燒滅菌
在無菌操作時，把鑷子、剪刀、解剖刀等浸入95%的酒精中，使用之前取出在酒精燈火焰上灼燒滅菌。冷卻后，立即使用。操作中可采用250或500毫升的廣口瓶，放入95%的酒精，以便插入工具。
3、玻璃器皿及耐熱用具采用干熱滅菌
干熱滅菌是利用烘箱加熱到160-180℃的溫度來殺死微生物。由于在干熱條件下，細菌的營養細胞的抗熱性大為提高，接近芽孢的抗熱水平，通常采用170℃持續90分鐘來滅菌。干熱滅菌的物品要預先洗凈并干燥，工具等要妥為包扎，以免滅菌后取用時重新污染。包扎可用耐高溫的塑料。滅菌時應漸進升溫，達到預定溫度后記錄時間。烘箱內放置的物品的數量不宜過多，以免防礙熱對流和穿透，到指定時間斷電后，待充分冷涼，才能打開烘箱，以免因驟冷而使器皿破裂。干熱滅菌能源消耗太大，浪費時間。
4、不耐熱的物質采用過濾滅菌
一些生長調節劑，如赤霉素、玉米素、脫落酸和某些微生物是不耐熱的，不能用高壓滅菌處理，通常采用過濾滅菌方法。
一些化學成分在高溫高壓下回發生降解而失去效能或降低效能。經高溫滅菌后赤霉素GA3的活性僅及不經高溫滅菌的新鮮溶液的10%。蔗糖經高溫后部分被降解成D-葡萄糖和D-果糖，果糖又可被部分水解，產生抑制培養的植物組織生長的物質。高溫還可使碳水化合物和氨基酸發生反應。IAA，NAA，2，4-D、激動素和玉米素在高溫下是比較穩定的。維生素具有不同程度的熱穩定性，但如果培養基的PH值高于5.5，則維生素B1會被迅速降解。泛酸鈣、植物組織提取物等要過濾滅菌，不能高溫滅菌，否則會失去作用。
防細菌濾膜的網孔的直徑為0.45微米以下，當溶液通過濾液后，細菌的細胞和真菌的孢子等因大于濾膜直徑而被阻，在需要過濾滅菌的液體量大時，常使用抽濾裝置；液量小時，可用注射器。使用前對其高壓滅菌，將濾膜裝在注射器的靠針管處，將待過濾的液體裝入注射器，推壓注射器活塞桿，溶液壓出濾膜，從針管壓出的溶液就是無菌溶液。
過濾除菌操作步驟：shou先將過濾器、接液瓶用紙包好，濾膜可放在培養皿內用紙包好。使用前先經121℃高壓蒸汽滅菌30分鐘；在超凈工作臺上，將濾器裝置裝好，用滅菌無齒鑷子將濾膜安放在隔板上，濾膜粗糙面向上；然后將待除菌的液體注入濾器內，開動真空泵即可過濾除菌。濾液經培養證明無菌生長后可保存備用。 
5、空間采用紫外線和熏蒸滅菌
（1）紫外線滅菌 在接種室、超凈臺上或接種箱用紫外燈滅菌。紫外線滅菌是利用輻射因子滅菌，細菌吸收紫外線后，蛋白質很核酸發生結構變化，引起細菌的染色體變異，造成死亡。紫外線的波長為200-300nm，其中260nm的殺菌能力**強，但是由于紫外線的穿透能力很弱，所以只適于空氣和物體表面的滅菌，而且要求距照射物以不超過1.2米為宜。
（2）熏蒸滅菌 用加熱焚燒、氧化等方法，使化學藥劑變為氣體狀態擴散到空氣中，以殺死空氣和物體表面的微生物。這種方法簡便，只需要把消毒的空間關閉緊密即可。
化學消毒劑的種類很多，它們使微生物的蛋白質變性，或競爭其酶系統，或降低其表面張力，增加菌體細胞漿膜的通透性，使細胞破裂或溶解。一般說來，溫度越高，作用時間越長，殺菌效果越好。另外，由于消毒劑必須溶解于水才能發揮作用，所以要制成水溶狀態，如升汞與高錳酸鉀。還有消毒劑的濃度一般是濃度越大，殺菌能力越強，但石炭酸和酒精例外。
常用熏蒸劑是甲醛，熏蒸時，房間關閉緊密，按5-8ml/m3用量，將甲醛置于廣口容器中，加5g/m3高錳酸鉀氧化揮發。熏蒸時，房間可預先噴濕以加強效果。冰醋酸也可進行加熱熏蒸，但效果不如甲醛。
6、一些物體表面用藥劑噴霧滅菌
物體表面可用一些藥劑涂搽，噴霧滅菌。如桌面、墻面、雙手、植物材料表面等，可用75%的酒精反復涂搽滅菌，1%-2%的來蘇兒溶液以及0.25%-1%的新潔爾滅也可以。
7、植物材料表面用消毒劑滅菌
從外界或室內選取的植物材料，都不同程度地帶有各種微生物。這些污染源一旦帶入培養基，便會造成培養基污染。因此，植物材料必須經嚴格的表面滅菌處理，再經無菌操作手續接種到培養基上，這一過程叫做接種。接種的植物材料叫做外植體（explant)。
shou先，將采來的植物材料除去不用的部分，將需要的部分仔細洗干凈，如用適當的刷子等刷洗。把材料切割成適當大小，即滅菌容器能放入為宜。置自來水龍頭下流水沖洗幾分鐘**數小時，沖洗時間視材料清潔程度而宜。易漂浮或細小的材料，可裝入紗布袋內沖洗。流水沖洗在污染嚴重時特別有用。
洗時可加入洗衣粉清洗，然后再用自來水沖洗洗衣粉水。洗衣粉可除去輕度附著在植物表面的污物，除去脂質性的物質，便于滅菌液的直接接觸。當然，**理想的清洗物質是表面活性物質吐溫。
第二步是對材料的表面浸潤滅菌。要在超凈臺或接種箱內完成，準備好消毒的燒杯、玻璃棒、70%酒精、消毒液、無菌水、手表等。用70%酒精浸10-30秒。由于酒精具有使植物材料表面被浸濕的作用，加之70%酒精穿透力強，也很易殺傷植物細胞，所以浸潤時間不能過長。有一些特殊的材料，如果實、花蕾、包有苞片、苞葉等的孕穗，多層鱗片的休眠芽等等，以及主要取用內部的材料，則可只用70%酒精處理稍長的時間。處理完的材料在無菌條件下，待酒精蒸發后再剝除外層，取用內部材料。
第三步是用滅菌劑處理。表面滅菌劑的種類較多，可根據情況選取1-2種使用見下表。
常用滅菌劑使用濃度及效果比較表
滅菌劑名稱 使用濃度% 消毒難易 滅菌時間 滅菌效果
酒精 70-75 易 0.1-3 好
氯化汞 0.1-0.2 較難 2-10 **好
漂白粉 飽和溶液 易 5-30 很好
次氯酸鈣 9-10 易 5-30 很好
次氯酸鈉 2（活性氧） 易 5-30 很好
過氧化氫 10-12 **易 5-15 好
抗菌素 4-50mg/L 中 30-60 較好
上述滅菌劑應在使用前臨時配制，氯化汞可短期內儲用。次氯酸鈉和次氯酸鈣都是利用分解產生氯氣來殺菌的，故滅菌時用廣口瓶加蓋較好；升汞是由重金屬汞離子來達到滅菌的；過氧化氫是分解中釋放原子態氧來殺菌的，這種藥劑殘留的影響較小，滅菌后用無菌水漂洗3-4次即可；由于升汞液滅菌的材料，難以對升汞殘毒去除，所以應當用無菌水漂洗8-10次，每次不少于3分鐘，以盡量去除殘毒。
滅菌時，不瀝干的植物材料轉放到燒杯或其他器皿中，記好時間，倒入消毒溶液，不時用玻璃棒輕輕攪動，以促進材料各部分與消毒溶液充分接觸，驅除氣泡，使消毒徹底。在快到時間之前1-2分鐘，開始把消毒液傾入一備好的大燒杯內，要注意勿使材料倒出，氫凈后立即倒入無菌水，輕攪漂洗。滅菌時間是從倒入消毒液開始，**倒入無菌水時為止。記錄時間還便于比較消毒效果，以便改正。滅菌液要充分浸沒材料。寧可多用些滅菌液，切勿勉強在一個體積偏小的容器中使用很多材料滅菌。
在滅菌溶液中加吐溫-80或Triton X效果較好，這些表面活性劑主要作用是使藥劑更易于展布，更容易浸入到滅菌的材料表面。但吐溫加入后對材料的傷害也在增加，應注意吐溫的用量和滅菌時間，一般加入滅菌液的0.5%，即在100ml加入15滴。
**后一步是用無菌水漂洗，漂洗要求3分鐘左右，視采用的消毒液種類，漂洗3-10次左右。無菌水漂洗作用是免除消毒劑殺傷植物細胞的副作用。